DNA hibridizasyonunun altında yatan nedir? Çift sarmallı DNA dizisi fizyolojik koşullar altında genellikle kararlı olmasına rağmen, bu koşulların laboratuvarda değiştirilmesi (tipik olarak ortam sıcaklığını yükselterek) moleküllerin ayrı ayrı sarmallara ayrılmasına neden olur. Sonuncusu birbirini tamamlayıcıdır, ancak çevrelerinde bulunan diğer dizileri de tamamlayabilir. Ortam sıcaklığının düşürülmesi, tek sarmallı moleküllerin birbirleriyle tavlanmasına veya "melezleşmesine" izin verir. Bu DNA hibridizasyon yöntemidir.
Moleküler biyoloji açısından kavram
DNA replikasyonu ve DNA'nın RNA'ya transkripsiyonunda yer alan bilim adamları, nükleotid çaprazlamalarına ve moleküler biyoloji tekniklerine güvenirler. Bu, Southern ve Northern blot'ları, polimeraz zincir reaksiyonunu (PCR) ve çoğu DNA-RNA hibridizasyonu ve dizileme yaklaşımını içerir.
Uygulama
Hibridizasyon, nükleotidin ana özelliğidirdiziler ve moleküler biyolojinin sayısız yönteminde kullanılır. İki türün genel genetik ilişkisi, DNA'larının segmentlerinin hibritlenmesiyle (DNA-DNA hibridizasyonu) belirlenebilir. Yakın akraba organizmalar arasındaki dizi benzerlikleri nedeniyle, bu tür DNA hibritlerini eritmek için daha uzak organizmalara kıyasla daha yüksek bir sıcaklık gereklidir. Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) dahil olmak üzere bir DNA örneğinin kökenini belirlemek için hibridizasyon çeşitli yöntemler kullanır. Başka bir yöntemde, eksprese edilen genleri tanımlamak için kısa DNA dizileri hücresel mRNA'ya hibritlenir. İlaç şirketleri, istenmeyen mRNA'ya bağlanmak ve ribozomun mRNA'yı proteine çevirmesini engellemek için antisens RNA'nın kullanımını araştırıyor.
DNA-DNA hibridizasyonu genellikle DNA dizileri havuzları arasındaki genetik benzerlik derecesini ölçen bir moleküler biyoloji tekniğine atıfta bulunur. Genellikle iki organizma arasındaki genetik mesafeyi belirlemek için kullanılır. Filogeni ve taksonomide yaygın olarak kullanılmaktadır.
Metodoloji
Bir organizmanın DNA'sı etiketlendi, ardından onunla karşılaştırılabilecek etiketlenmemiş DNA ile karıştırıldı. Karışım, DNA zincirlerinin ayrışmasına izin vermek için inkübe edilir ve daha sonra rejenere edilmiş hibrit çift sarmallı bir DNA oluşturmak üzere soğumaya bırakılır. Yüksek derecede benzerliğe sahip hibritleştirilmiş diziler daha sıkı bağlanır ve onları ayırmak için daha fazla enerji gerektirir: yani, daha yüksek bir sıcaklıkta ısıtıldıklarında ayrılırlar.sıcaklık, "DNA erimesi" olarak bilinen bir işlemdir.
DNA erime
Hibritlenmiş DNA'nın erime profili değerlendirildiğinde, çift sarmallı DNA "sütun" adı verilen bir şeye bağlanır ve elde edilen karışım ısıtılır. Her adımda kolon yıkanır ve eriyen DNA dizileri tek iplikli hale gelir ve kolonu yıkar. Etiketli DNA'nın kolondan çıktığı sıcaklıklar, diziler arasındaki benzerlik miktarını yansıtır (ve kendi kendine katlanan model bir kontrol işlevi görür). Bu sonuçlar, organizmalar arasındaki genetik benzerlik derecesini belirlemek için birleştirilir. Modern mikrobiyolojiye göre, bunları anlamadan DNA hibridizasyonu imkansızdır.
Birden fazla ribonükleik asit (veya deoksiribonükleik) asit türü bu şekilde karşılaştırıldığında benzerlik değerleri türlerin filogenetik ağaçta yer almasına olanak sağlar. Bu nedenle, moleküler sistematiği yürütmek için olası yaklaşımlardan biridir. Bu tekniğin öncüleri Charles Sibley ve John Ahlquist, kuşların (Sibley-Ahlquist taksonomisi) ve primatların filogenetik ilişkilerini incelemek için DNA-DNA hibridizasyonunu kullandılar.
Biyoloji için önemi
DNA-DNA hibridizasyonu, bakteri türlerini ayırt etmek için altın standarttır ve %70'in üzerinde bir benzerlik değeri ile karşılaştırılan suşların farklı türlere ait olduğunu gösterir. 2014 yılında, bir bakteri alt türünü ayırmak için %79 benzerlik eşiği önerildi.
Eleştirmenler, organizmalar arasındaki ortolog diziler arasındaki farklılıkları ölçmeye yönelik herhangi bir girişim, bir organizmanın genomundaki paralog eşlerin hibridizasyonu tarafından boğulduğundan, tekniğin yakından ilişkili türleri karşılaştırmak için yanlış olduğunu iddia ediyor. DNA dizilimi ve hesaplamalı dizi karşılaştırmaları, şu anda genetik mesafeyi belirlemek için yaygın olarak kullanılan yöntemdir, ancak bu yaklaşım bakterileri tanımlamaya yardımcı olmak için mikrobiyolojide hala kullanılmaktadır.
Mevcut yol, tamamen veya kısmen sıralanmış genomları kullanarak silikonda DNA-DNA hibridizasyonunu gerçekleştirmektir. DSMZ tarafından geliştirilen GGDC, DDH benzeri değerleri hesaplamak için bilinen en doğru araçtır. Diğer algoritmik iyileştirmelerin yanı sıra, iki genom dizisi arasındaki eşleşmelerden dikkatlice filtreleyerek paralog dizilerle ilgili sorunu çözer.
BALIK yöntemi
Floresan In Situ Hibridizasyon (FISH), genellikle belirli bir kromozom üzerinde DNA'yı saptamak ve sıralamak için kullanılan bir laboratuvar tekniğidir.
1969'da Joseph Gall ve Mary Lou Pardu, ribozomal DNA dizisinin radyoaktif kopyalarının bir kurbağa yumurtasının çekirdeğindeki tamamlayıcı DNA dizilerini tespit etmek için kullanılabileceğini gösteren bir makale yayınladı. Bu orijinal gözlemlerden bu yana, birçok iyileştirme çok yönlülüğü artırdı veprosedürün duyarlılığı, in situ hibridizasyon ("yerinde", Latince) artık sitogenetikte önemli bir araç olarak kabul edilir. (In situ terimi artık, patolojik sürece yalnızca epitel dokusunun dahil olduğu karsinom büyümesinin ilk aşamasını belirtmek için de kullanılmaktadır.)
Floresan hibridizasyon dizisi
RNA probları, dokularda ve hücrelerde lncRNA ve miRNA mRNA'yı görselleştirmek için herhangi bir gen veya bir gen içindeki herhangi bir dizi için tasarlanabilir. FISH, herhangi bir kromozomal anormallik için özellikle nükleer interfaz olmak üzere hücre üreme döngüsü incelenerek kullanılır. FISH, çok sayıda arşiv vakasını analiz etmenize olanak tanır, benzer kromozomları çekecek yapay bir kromozom tabanına sahip bir prob oluşturarak tanımlanan kromozomu tanımlamak çok daha kolaydır.
Bir nükleer anormallik tespit edildiğinde her prob için hibridizasyon sinyalleri: her mRNA ve lncRNA saptama probu, 20 çift oligonükleotitten oluşur, her bir çift 40-50 bp'lik bir alanı kaplar. s. Sondalar, mRNA'yı saptamak için özel kimyayı kullanır.
DNA problarıyla hibridizasyon
Sondalar genellikle insan genomunun tasarımında kullanılmak üzere izole edilmiş, saflaştırılmış ve amplifiye edilmiş DNA parçalarından yapılır. İnsan genomunun boyutu, doğrudan dizilenebilen uzunluğa kıyasla o kadar büyüktür ki, onu ikiye bölmek gerekir.parça. Son olarak, bu fragmanlar, büyük fragmanların birbiriyle nerede örtüştüğünü belirlemek için bu bilgiyi kullanarak boyut dışlama kromatografisini kullanarak her küçük fragmanın boyutunu ölçmek için diziye özgü endonükleazlar kullanılarak her fragmanın bir kopyasının daha da küçük birimlere sindirilmesiyle sipariş edildi..
Elementleri kendi DNA dizileriyle korumak için, parçalar sürekli tekrar eden bakteri popülasyonlarından oluşan bir sisteme eklendi. Klonal bakteri popülasyonları, her popülasyonda tek bir yapay kromozom bulunur ve dünyadaki çeşitli laboratuvarlarda depolanır. Yapay kromozomlar (BAC'ler), bir kütüphane içeren herhangi bir laboratuvarda büyütülebilir, çıkarılabilir ve etiketlenebilir. Genomik kütüphaneler genellikle geliştirildikleri kurumların isimleriyle anılırlar. Bir örnek, Buffalo'daki (New York, ABD) Roswell Kanser Enstitüsü'nün adını taşıyan RPCI-11 kitaplığıdır. Bu parçalar yaklaşık 100 bin baz çifti oluşturur ve çoğu FISH probunun temelidir.
