Gram boyama, bakterileri hücre duvarlarının bileşimine göre ayırt etmenin en kolay yollarından biri olduğu için mikrobiyolojide yaygın olarak kullanılmaktadır. Gram'a göre, tüm bakteriler gram pozitif (Gram (+)) ve gram negatif (Gram (-)) olarak ayrılabilir. Gram boyama yöntemi 1884'te geliştirildi ve o zamandan beri birkaç kez modifiye edilmesine rağmen popülerliğini kaybetmedi.
Hücre duvarı yapısı
Gram boyama, bir bakterinin Gram pozitif mi yoksa Gram negatif mi olduğunu ortaya çıkarır. Bakterilerin Gram (+) ve Gram (-) olarak bölünmesi hücre duvarlarının yapısına göre gerçekleşir.
Hücre duvarı en fazla miktarda peptidoglikan (murein) içerir - peptapeptid ve glikan içeren karmaşık bir madde. Glikan, birbirine β-1 ile bağlı N-asetilglukozamin ve N-asetilmuramik asidin değişen tortularından oluşur,4-glikosidik bağlar. Peptidoglikan hücre şeklinin korunması, ozmotik koruma ve antijenik fonksiyonlar sağlar.
Gram-pozitif ve Gram-negatif bakteriler arasındaki temel farklar
Farklı bakterilerin farklı peptidoglikan tabaka kalınlıkları vardır. Gram pozitif olarak sınıflandırılan bakterilerde 15 ila 80 nm arasında değişirken, gram negatif olarak 2 ila 8 nm arasındadır. Aynı zamanda, Gram-negatif bakteriler, Gram-pozitif bakterilerin sahip olmadığı peptidoglikan tabakasının altında özel bir yapıya sahiptir - periplazmik boşluk. Bu boşluk hidrolitik enzimlerle doldurulur - β-laktamaz, ribonükleaz 1, fosfataz. Gram negatif bakterilerin birçok antibiyotiğe direncinden sorumlu olan bu enzimlerdir.
Bakterilerin Gram(-) peptidoglikan tabakası, endotoksin içeren antijenik bir yapı olan lipopolisakarite bağlıdır. Gram(+) bakterilerde, teikoik asitler benzer işlevleri yerine getirir.
Gram-negatif bakterilerin ek bir yapısı vardır - dış zar.
Boyama yönteminin özü
Boyama başlamadan önce, incelenen bakterilerin yaymaları hazırlanır. Bunu yapmak için, bir cam slayt üzerine su damlatılır ve oraya bir bakteri döngüsü ile bir mikroorganizma kültürü eklenir. Ardından, su tamamen kuruduktan sonra, leke sabitlenir - cam sürgü, brülör alevi üzerinde birkaç kez taşınır. Gram boyama, canlı bakteri boyamadan daha etkilidir - boya molekülleri ölü hücrelere daha iyi bağlanır.
Boyama birkaç aşamada yapılır:
- Küçük filtre kağıdı parçaları sabit bir leke üzerine yerleştirilir ve ana boya dökülür - enziyan menekşesi veya metilen mavisi.
- 3-5 dakika sonra renkli filtre kağıdını çıkarın ve smear'ı 1 dakika Lugol solüsyonu ile doldurun. Bu durumda hazırlık koyulaşır.
- Lugol solüsyonu boş altılır ve yayma saf etil alkol ile işlenir: preparasyon üzerine birkaç damla damlatılır, 20 saniye sonra boş altılır. İşlem 2-3 kez tekrarlanır.
- Test lamını distile su ile durulayın.
- Ek boyama üretin - hazırlığı fuksin ile tamamlayın. 1-2 dakika sonra boya yıkanır.
- Su kuruduktan sonra yaymayı mikroskop altında inceleyin. Gram pozitif bakteriler mavi-mor, Gram negatif bakteriler pembe veya kırmızı olacaktır.
Farklı boyama desenlerinin nedenleri
Yukarıda açıklandığı gibi, bakterilerin Gram boyaması, Gram-pozitif bakterileri mavi-mor boyarken, Gram-negatif bakterileri kırmızı veya pembe boyar. Bakterilerin bu yöntemle farklı boyanmasının nedeni, centiyana menekşesinin çözünür formu hücreye girdikten sonra boyanın çözünmeyen iyot formuna geçmesidir. Bakterilerin etil alkol ile muamelesi sırasında, bu polar olmayan çözücünün etkisi altında zardan lipitler çıkarılır. Membran daha sonra gözenekli hale gelir ve artık boya sızıntısı için önemli bir engel teşkil etmez. Yine dePeptidoglikan, alkol de dahil olmak üzere polar olmayan çözücülere karşı daha dirençlidir. Boyanın yıkanmasını önleyen kişidir, bu nedenle kalın bir murein tabakası olan bakteriler mavi-mor (gram-pozitif) olur ve alkol ile tedavi edildikten sonra renklerini değiştirmezler.
Gram-negatif bakterilerin ince mürein tabakası hücrede boya moleküllerini tutamaz, bu nedenle alkolün etkisinden sonra renksiz hale gelirler - leke gram-negatif.
Bir yaymanın fuksin'e maruz kalmasından sonra, Gram boyalı bakteriler mavi-mor olarak kalırken Gram-negatif bakteriler pembe-kırmızı olur.
Gram(+) ve Gram(-) bakteri örnekleri
Gram-negatif bakteriler arasında siyanobakteriler, kükürt bakterileri, demir bakterileri, klamidya, riketsiya, asetik bakteriler, birçok metilobakteri, tiyonik bakteri, arsenitobakteri, karboksibakteri bulunur.
Bifidobakteriler, birçok suda yaşayan bakteri, streptokok ve stafilokok Gram pozitiftir.
