Bakterilerin yetiştirilmesi: yöntemler, ilkeler, adımlar ve koşullar

2024 Yazar: Angel Austin | [email protected]. Son düzenleme: 2023-12-17 05:44

Çevremizdeki doğada bulunan mikroorganizmalar her yerdedir: toprakta, su kütlelerinde, çeşitli nesnelerin yüzeylerinde, insanlarda ve hayvanlarda yaşarlar. Bütün bunlar, gıda, ilaç ve üretim hatlarının mikrobiyal kontaminasyonu kaynakları olarak hizmet edebilir. Bakterilerin yetiştirilmesi, özelliklerini, ihtiyaçlarını ve özelliklerini incelemek için gereklidir. Bu da çeşitli ilaçların geliştirilmesinde, hastalıkların laboratuvar teşhisinde, üretim reaktörlerinin hesaplanmasında ve çok daha fazlasında önemli bir adımdır.

Genel kavramlar

Mikrobiyolojide bakteri kültürü, laboratuvarda gerçekleştirilen mikroorganizmaların yetiştirilmesini ifade eder. Sırasıyla, seçilmiş bir besin ortamında büyüyen mikroplara kültür denir. Kültürler, farklı mikroorganizma türleri tarafından oluşturulmuşsa karıştırılabilir ve yalnızca bir tür bakteri tarafından temsil ediliyorsa saf olabilir.

BesleniyorsaOrtama sadece bir hücre yerleştirilir ve çoğ altılması sonucunda bir grup birey elde edilir, daha sonra bu mikroorganizma grubuna klon denir. Bir klon çıplak gözle görülebilecek kadar geliştiğinde, bu bakteri koleksiyonuna koloni denir.

Genellikle farklı kaynaklardan izole edilen bakterilerin ekimi birbirinden ayrı gerçekleştirilir. Bu tür ayrı ayrı büyütülmüş mikrop gruplarının her birine bir tür denir. Bu nedenle, bir stafilokok türü üç kaynaktan (veya aynı ürünün farklı bölümlerinden, farklı kişilerden) izole edilirse, bu tür stafilokokların üç türünden bahsederler.

Bakteri Büyüme Faktörleri

Bunlar, çeşitli amino asitleri, lipidleri, pürin bazlarını ve mikroorganizmaların gelişimi için gerekli diğer bileşikleri içerir. Bazı mikroplar ihtiyaç duydukları maddeleri bağımsız olarak üretebilirken, diğerlerinin bunları bitmiş formda alması gerekir. Belirli büyüme faktörlerinde mikroorganizmaların ihtiyaçlarına göre bakterilerin tanımlanması ve ayrıştırılması gerçekleştirilir. Ayrıca bu parametre, laboratuvar ve biyoteknolojik çalışma için bir besin ortamının doğru hazırlanması için önemlidir:

Amino asitler. Bakteriler, belirli bir amino asit veya asit grubu gerektirebilir. Yani, klostridia lösin ve tirozine ihtiyaç duyar, streptokoklar lösin ve arginine ihtiyaç duyar. Büyümek için dışarıdan amino asitlere ihtiyaç duyan mikroorganizmalara oksotrof denir.
Pürin ve pirimidin bazları ve bunların türevleri (adenin, guanin ve diğerleri). Birçok kişinin büyümesinde önemli bir faktördürler. Streptokok türleri.
Vitaminler. Bakterilerin ihtiyaç duyduğu koenzimlerin bir parçasıdırlar. Bu nedenle, NAD ve NADP'nin bir parçası olan amidinin yanı sıra nikotinik asit, difteri ve shigella corynebacteria tarafından gereklidir. Tiamin, pirofosfatın ayrılmaz bir parçası olarak Staphylococcus aureus, pneumococcus, brusella tarafından gereklidir. CoA koenziminin bir parçası olan pantotenik asit, tetanoz basili ve belirli streptokok türleri için gereklidir. Sitokromlar ve dolayısıyla onları oluşturan folik asit, hemes ve biotin, Mycobacterium tuberculosis ve Haemophilus influenzae için gereklidir.

Çevre Gereksinimleri

Bakteri kültürü için kültür ortamı koşulları:

Beslenme. Ayrıca, mikroorganizmaların beslenmesi ve enerjiyi yenilemesi için gerekli olan, kolayca sindirilebilir bir biçimde maddeler içermelidirler. Bunlara organojenler ve mineraller dahildir. Bazı mikroorganizmalar ayrıca sentezleyemedikleri vitaminlere ve amino asitlere ihtiyaç duyarlar.
Optimum pH seviyesi. Hücre zarının geçirgenliğini ve buna bağlı olarak bakteri tarafından besinleri emme yeteneğini etkiler. Çoğu zaman pH değeri 7, 2–7, 4 seviyesinde olmalıdır. Birçok mikroorganizma yaşamları boyunca asidik veya alkali reaksiyonlu ürünler üretir ve besin ortamının pH'ının değişmemesi için, arabelleğe alınmalıdır.
İzotonik. Bakterilerin yetiştirilmesi için besin ortamındaki ozmotik basınç, aşağıdakilerle aynı değerlere sahip olmalıdır.mikrobiyal hücrelerin içinde. Genellikle %0.5'lik bir NaCl çözeltisine karşılık gelir.
Kısırlık. Bunun nedeni, yabancı bakterilerin ortaya çıkmasının, analiz edilen suşun çalışmasının sonuçlarını çarpıtmasıdır.
Nem seviyesi. Bu gösterge, ortamın tutarlılığı ile birlikte belirli bir bakteri türü için optimal özelliklere sahip olmalıdır.
Redoks potansiyeli (RH2). Elektron veren ve kabul eden maddelerin oranını ve ayrıca besin ortamının oksijen doygunluk seviyesini gösterir. Aeroblar ve anaeroblar için, bakteri yetiştirme koşulları bu göstergede biraz farklıdır. Anaerobik mikroorganizmalar en iyi 5'in altındaki RH2 değerlerinde ve aerobik mikroorganizmalar en az 10'da ürerler.
Tekdüzelik. Kültür ortamının kendi bileşenlerinden sabit miktarlarda içermesi önemlidir. Ek olarak, mahsul büyümesini izlemeyi veya kontaminasyonu fark etmeyi kolaylaştıran net çözümler tercih edilir.

Kültür medyası türleri

Mikroorganizmaları büyütmek için belirli bir ortamın seçimi, beslenmelerinin özellikleri ve çalışmanın amacı gibi birçok faktörden etkilenir. Besin ortamlarının sınıflandırılmasının altında yatan ana özellikler şunlardır:

1. Bileşenler. Substratı oluşturmak için kullanılan ilk maddelere göre, ayırt ederler:

doğal, hayvansal veya bitkisel kaynaklı ürünlerden (örneğin et, süt, meyve) hazırlanan ve karışık yetiştirmeye uygunekinler;
Yarı sentetik, pahalı doğal gıda ürünlerinin yerini gıda dışı ürünlerle (örneğin kemik unu, kan pıhtıları) alan ve belirli bakteri türlerini yetiştirmek veya onların metabolik ürünlerini bakterilerden izole etmek için en uygun olan yarı sentetik. çevre;
Kesin miktarlarda kimyasal bileşiklerden hazırlanan sentetikler, bilinen sabit bir bileşime sahiptir ve kolayca yeniden üretilebilir.

2. Tutarlılık (yoğunluk). Ortamları ayırt edin:

sıvı;
yoğun;
yarı sıvı.

Son ikisi, gerekli yoğunluğu oluşturmak için agar-agar veya jelatin ilavesiyle özel solüsyonlardan veya sıvı maddelerden hazırlanır. Ek olarak, bakterilerin büyümesi için yoğun bir ortam, pıhtılaşmış kan serumu, patates, silika jel ortamı, karagenandır.

3. Birleştirmek. Bu temelde, ortamlar şunlardır:

basit, listesi kısa olan Meat Peptone Broth (MBB), Hottinger Broth ve Agar, Meat Peptone Agar (MPA), besleyici jelatin ve peptonlu su.
Kompleks, basit olanlardan kan, peynir altı suyu, karbonhidratlar ve diğer maddelerin eklenmesiyle hazırlanır.

4. Randevu. Aşağıdaki besin ortamları ayırt edilir:

main birçok patojenik mikrop yetiştirmek için kullanılır (genellikle basit bileşim);
Basit yüzeylerde gelişmeyen bakterileri izole etmek ve yetiştirmek için özel olanlar kullanılır;
seçici (aynı zamanda seçicidirler) belirli bir bakteri türünü izole etmek için uygundur ve ilişkili mikropların büyümesini engeller (seçicilikortama antibiyotikler veya tuzlar gibi belirli maddeler eklenerek veya pH ayarlanarak oluşturulur);
Diferansiyel teşhis, örneğin ortamın enzimatik aktivitesini değerlendirerek bir bakteri türünü diğerinden ayırt etmeyi mümkün kılar;
mikroorganizmaların ölümünü önledikleri ve diğer bakterilerin büyümesini engelledikleri için örneklerin sonraki taşınması ile ilk aşılama için koruyuculara ihtiyaç vardır.

Medya hazırlığı

Anaerobik bakterilerin yetiştirilmesindeki en önemli adım, uygun bir besin ortamının hazırlanmasıdır. Optimum parametreler seçildikten sonra aşağıdaki aşamalara geçin:

analitik bir terazide bileşenlerin bir örneğini seçerek tartma;
70 °C'ye ısıtılmış damıtılmış suda gerçekleştirilen çözündürme ve fosfatlar, mikro ve makro tuzlar ayrı ayrı çözülür;
su banyosunda iki dakika kaynatmak;
pH belirleme, gösterge kağıdı veya potansiyometre;
sıvı ve ayrıca erimiş yoğun ortam için ıslak bez veya kağıt filtreler ve agar ortam için pamuklu gazlı bez filtre ile filtreleme;
3/4 kapasitede gerçekleştirilen şişeleme;
orta bağımlı sterilizasyon;
sterillik kontrolü iki gün bir termostata oturtularak ve ardından izlenerek gerçekleştirilir;
pH'ı ve gerekli içeriği belirlemek için kimyasal kontrolöğeler;
deneme aşılama ile biyolojik kontrol.

Cam eşya ve ortamların sterilizasyonu

Bakteri yetiştirmenin temel ilkelerinden biri kısırlıktır. Yabancı mikroorganizmaların büyümesi ve gelişmesi, kimyasal bileşimini ve pH'ını değiştirerek besin ortamının özelliklerini etkileyebilir. Saf kültürlerin yetiştirilmesi için temel koşul sterilizasyondur. Pratikte bu terim, sterilize edilmiş nesnelerin yüzeyinde ve hacminde kesinlikle tüm yaşam formlarının yok edilmesi yöntemleri anlamına gelir. Çalışma sırasında kullanılan kaplar, kullanılan aletler, ortam ve diğer öğeler sterilize edilir.

Bazı sterilizasyon türleri:

Ateşleme. Tohumlama için halkaların ve iğnelerin sterilizasyonu, cam slaytlar, bazı aletler bir brülör veya ispirto lambası kullanılarak yapılabilir.
Kaynatma. Şırıngalar, iğneler, yiyecekler için uygundur, ancak bakteri sporlarını öldürmez.
Kuru ısı sterilizasyonu. Özel bir kurutma kabininde gerçekleştirilir ve şişelerin, test tüplerinin ve diğer laboratuvar cam eşyalarının işlenmesi için uygundur.
Buhar sterilizasyonu. Otoklavda gerçekleştirilen bu yöntem oldukça etkilidir. Ancak yüksek sıcaklıklarda parçalanan proteinler veya diğer bileşikler içeren besin ortamları için uygun değildir. Daha fazla tasarruf, tyndalizasyon olarak adlandırılabilir. Koch Kazanında gerçekleştirilir ve sporların çimlenmesini onların yok edilmesiyle birleştirir.
Pastörizasyon. Kaynatıldığında özelliklerini değiştiren (örneğin süt, şarap, bira) ortamlar için kullanılır.onları sporsuz mikroorganizmalardan arındırın. İşlem sıcaklığı, on beş ila otuz dakika boyunca sadece 50-60 ° C'dir. Bazı durumlarda, filtreler veya UV ışınları kullanılarak gerçekleştirilen soğuk sterilizasyon kullanılır.

Bakteri yetiştirme koşulları

Bakterilerin büyümesi ve gelişmesi ancak belirli faktörler ve her birinin değerleri altında mümkündür:

1. Hava sıcaklığı. Sıcaklık tercihlerinde farklılık gösteren üç bakteri grubu vardır:

termofiller veya sıcağı seven mikroplar 45-90°C'de büyür, yani insan ve hayvan organizmalarında çoğalmazlar;
psikrofiller veya soğuğu seven mikroorganizmalar, 5-15 °C aralığındaki sıcaklıkları tercih ederler ve soğuk hava depolarında yetiştirilirler;
mezofiller, 25-37 °C sıcaklıkta gelişirler, bakteri yığınını içerirler.

2. Işık. Fotosentetik süreci yürüttükleri için fototrofik bakterilerin yetiştirilmesinin bir özelliğidir. Ancak çoğu mikrop için aydınlatma bir ön koşul değildir. Ve tam tersi bile, solar ultraviyole onların gelişimini engelleyebilir.

3. Suçlu. Tüm mikroorganizmaların erişilebilir (sıvı) formda suya ihtiyacı vardır. Bu nedenle donmuş yiyeceklerde bakteri üremesi çok azdır veya hiç yoktur.

4. Çevrenin asitliği. Bakteri yetiştirmenin bu ilkesi yukarıda ayrıntılı olarak tartışılmıştı.

5. Havalandırma. Oksijen, kimyasal bir element olarak suyun ayrılmaz bir parçasıdır ve bunun için kullanılan önemli sayıda bileşiktir.mikroorganizmaların yetiştirilmesi. Gaz halindeki oksijen ayrıca suda ve diğer sıvılarda çözünmüş halde bulunabilir. Bakterilerin önemli bir kısmı sürekli oksijen molekülü kaynağına ihtiyaç duyar. Ancak bazı mikroorganizmalar için gereksizdir veya daha da kötüsü, zehirli solunum ürünlerini yok eden katalaz ve peroksidazları olmadığı için gaz halindeki oksijen onlar için toksiktir. Bu nedenle anaerobik bakterilerin yetiştirilmesindeki en önemli adım, O₂ moleküllerinin besin ortamından uzaklaştırılmasıdır.

6. Mikroorganizmaların yetiştirilmesi. Aerobik ve anaerobik bakterilerin yetiştirilmesi ortamın farklı katmanlarında ve farklı modlarda gerçekleştirilir.

Aerobik mikroorganizmaların yetiştirilmesi

Aerobik bakterilerin yetiştirilmesi moleküler oksijen gerektirir. Tıpta ve gıda endüstrisinde başarıyla kullanılabilen saf aerob kültürleri elde etmek için aşağıdaki yöntemler kullanılır:

Oksijen doğrudan havadan geldiğinde yoğun ortamda veya sıvı ortamda (ince tabakaları) büyüyen yüzey;
Sıvı ortamda derin ekim, sürekli havalandırma ile içlerinde çözünmüş oksijen miktarında bir artış sağlandığında.

Anaerobik mikroorganizmaların yetiştirilmesi

Bu tür bakterileri yetiştirmenin temel prensibi, atmosferik oksijenle minimum düzeyde temas etmeleridir. Büyümeleri için koşullar sağlamak aeroblardan çok daha zordur. Anaerobları moleküler O₂:

'tan izole etmek için aşağıdaki yöntemler kullanılır.

Fiziksel. Bu anaerobik bakteri yetiştirme yöntemi, özel bir vakum aparatında - bir mikroanaerostatta yetiştirilmelerine indirgenir. İçindeki hava, %10 hidrojen ve %5 karbondioksit ilavesiyle özel bir gaz nitrojen karışımı ile değiştirilir.
Kimyasal. Bunlar şunları içerir: emici maddelerin kullanımı (örneğin Fe, Na₂S₂O₄, CuCl) veya indirgeyici ajanlar (askorbik asit gibi).
Biyolojik. Kapalı bir sistemde aerobların ve anaerobların birlikte yetiştirilmesine gelir. Bu bakteri yetiştirme yöntemi, bir Petri kabının yarısının bazı aerobik bakteri türleri ve diğer yarısının üzerinde çalışılan anaerob ile tohumlanmasını içerir. Gelişimi tüm oksijenin tükendiği anda başlayacak.

Aşağıdaki tohumlama yöntemleri anaerobik bakteri yetiştirmek için uygundur:

yüzey katmanında;
steril parafin ile doldurulmuş yüzey tabakasında;
yoğun bir besin ortamının kalınlığında;
viskoz ortamın derin katmanlarında.

Saf kültür elde etmek

Mikrobiyologlar genellikle birçok farklı mikrop türünün yaşadığı örneklerle çalışır. Bununla birlikte, mikroorganizmaların (aile, cins, tür) sistematik konumunu belirlemek ve özelliklerini incelemek için onları izole etmek ve saf bir kültür yetiştirmek gerekir. Peynir, ekmek, kvas, şarap vb. gibi birçok gıda endüstrisinde büyük önem taşırlar. Laktik asit bakterilerinin yetiştirilmesi, elde edilmesini mümkün kılar.fermente süt ürünleri, hamur, kakao, silaj ve hatta plastik üretimi için temel bir bileşen.

Yoğun bir ortamda saf bir kültürü izole etme yöntemi, mikroorganizma hücrelerinin mekanik olarak ayrılmasına ve sonraki izole ekimlerine dayanır. Numune steril hacimde su veya salin (hacim 10-100 mi) içine aktarılır ve ardından iki dakika çalkalanır. İncelenen materyalin kalınlığında (örneğin sosis veya peynir) bulunan mikroorganizmaları çıkarmak için önce numune parçalarının steril aletlerle kumla ovulması gerçekleştirilir. 1 gr ağırlığında veya 1 ml hacminde ön hazırlığı yapılmış malzeme steril su ile 10, 100, 1000 vb. kez seyreltilir. Seyreltme derecesi, yöntemin özelliklerine karşılık gelen bir hücre konsantrasyonu veren seçilir.

Mikroorganizmaların sonraki ekimi, bir besin ortamı hazırlamaktır. Genellikle yoğun bir ortam (MPA) seçilir. İlk önce eritilir ve 45-50 °C'ye soğutulur ve ancak daha sonra birkaç Petri kabına (üç ila beş parça) dökülür, bunların altına çeşitli konsantrasyonlarda test maddesinden swablar yerleştirilir. Daha sonra, henüz donmamış besin ortamının ve içine verilen malzemenin karıştırılması gerçekleştirilir. Hücreler, substrat hacminin çeşitli noktalarında bu şekilde sabitlenir.

Ardından, Petri kapları 2 gün boyunca 22 °C'de bir termostata yerleştirilir. Bu süre zarfında hücreler o kadar çoğalırlar ki, her bir hücrenin oluşturduğu koloni çıplak gözle görülebilir hale gelir. Her biri, hücrelerinden beslendiği bakteri türünün saf bir kültürüdür.gül.

Bundan sonra, Petri kaplarından mikroorganizmalar, bir besin ortamıyla doldurulmuş ayrı test tüplerine alt kültürlenir. Bu şekilde, saf kültürler karışık bir numuneden izole edilir. Bu yöntem, geliştiricisinin adını taşır - R. Koch. Aynı zamanda yaygın olarak fincan yöntemi veya tüketen ekim olarak da adlandırılır. Çeşitli bakteri türlerinin saf kültürleri elde edildikten sonra şekilleri, sporları ve aileleri belirlenir.

Tüm çalışmalar asepsi prensiplerine göre yapılmalıdır. Mikroorganizmaların erken gelişmesini önlemek için, çalışma numune alındıktan hemen sonra yapılmalıdır. Musluk suyu, borularda ve musluklarda biriken mikropları içerebileceğinden, ilk kısımlar boş altıldıktan sonra analiz edilir. Meyvelerin, meyvelerin ve sebzelerin mikroflorası esas olarak yüzeyde (kabuğu) bulunur, bu nedenle ondan yıkama yapılır. Bunu yapmak için fetüsü steril bir kaba koyun ve gerekli miktarda suyla doldurun. Daha sonra oldukça kuvvetli bir şekilde çalkalanır ve su başka bir kaba boş altılır. Kumaş ürünlerden elde edilen mahsuller de swablarda elde edilir, ancak önceden belirli bir boyutta parçalar kesilir.