Organik kimyadaki maddeleri incelerken, belirli bileşiklerin içeriğini belirlemek için bir düzineden fazla farklı kalitatif reaksiyon kullanılır. Böyle bir görsel analiz, gerekli maddelerin mevcut olup olmadığını hemen anlamanıza izin verir ve mevcut değilse, bunları tanımlamak için daha fazla deneyi önemli ölçüde az altabilirsiniz. Bu reaksiyonlar, amino bileşiklerinin görsel olarak belirlenmesinde ana olan ninhidrini içerir.
Bu nedir?
Ninhidrin, ikinci atomu 2 hidroksil grubuna (OH-) sahip bir heterosikl eklenmiş bir aromatik halka içeren bir dikarbonil bileşiğidir. Bu madde, inandion - 1, 3'ün doğrudan oksidasyonu ile elde edilir ve bu nedenle uluslararası terminolojiye göre şu ada sahiptir: 2, 2 - dihidroksiinandion -1, 3 (Şekil 1).
Saf ninhidrin sarı veya beyaz bir kristaldirısıtıldığında suda ve aseton gibi diğer polar organik çözücülerde iyi çözünen renkler. Bu oldukça zararlı bir maddedir, cilt ile büyük miktarlarda veya mukoza zarlarıyla temas ederse, solunması da dahil olmak üzere tahrişe neden olur. Bu bileşikle çalışmak dikkatli olmalı ve sadece eldivenlerle yapılmalıdır, çünkü cilt ile temas ettiğinde cilt hücre proteinleri ile reaksiyona girer ve mora boyar.
Reaktif Maddeler
Yukarıda bahsedildiği gibi, ninhidrin reaksiyonu öncelikle amino bileşiklerinin içeriğinin görsel olarak belirlenmesi için kullanılır:
- α-amino asitler (proteinler dahil);
- amino şekerler;
- alkaloidler –NH2 ve -NH grupları içeren;
- çeşitli aminler.
İkincil ve üçüncül aminlerin bazen çok zayıf tepki verdiğine dikkat edilmelidir, bu nedenle varlıklarını doğrulamak için daha fazla araştırmaya ihtiyaç vardır.
Kantitatif belirleme için çeşitli kromatografi yöntemleri kullanılır, örneğin kağıt kromatografisi (BC), ince tabaka kromatografisi (TLC) veya katı taşıyıcıların çeşitli ortamlarda bir ninhidrin çözeltisi ile yıkanması.
Amino bileşikleri için spesifik değildir, çünkü reaktif hepsi aynı anda içine girebilir. Bununla birlikte, reaksiyon ürünleri açısından, karbon dioksit kabarcıklarının (CO2) salınması şeklinde bir özelliği vardır ve bu sadece α-amino ile etkileşime girdiğinde tipiktir. asitler.
Mekanizma özellikleri
BLiteratürde ninhidrin reaksiyon denkleminin farklı yorumları vardır. Bazı araştırmacılar, amonyak ve ninhidrinin katılımıyla aynı zamanda "Rueman'ın moru" (veya "Rueman'ın mavisi") olarak adlandırılan bir renklendirici madde oluşturan 2-aminoinandion'dan hidrindantin oluşumunu atlarken, diğerleri, aksine, sadece onun varlığını varsayar. ara amino ürünlerinin varlığı olmadan katılım. Reaksiyonun kendi kaydında da bazı ilginç noktalar vardır, özellikle bu, bir boya oluşturmak için ninhidrinin amino türevini ana molekülüne bağlama yöntemleriyle ilgilidir. Sulu ortamdan ara amin tarafından elde edilen "yürüyen hidrojen"in yerinin belirtilmesi de tartışmalıdır: keton grubunda veya –NH2'nin yanında olabilir.
Gerçekte, H atomu ile olan nüans önemsizdir, çünkü bileşikteki konumu reaksiyonun seyrinde özel bir rol oynamaz, bu yüzden dikkat edilmemelidir. Olası aşamalardan birinin atlanmasına gelince, buradaki sebep teorik açıdan yatmaktadır: şimdiye kadar, Rueman morunun oluşumunun kesin mekanizması kesin olarak belirlenmemiştir, bu nedenle ninhidrin reaksiyonunun oldukça farklı şemaları bulunabilir.
Reaktifin amino bileşikleri ile mümkün olan en eksiksiz etkileşim süreci aşağıda önerilecektir.
Reaksiyon mekanizması
İlk olarak, ninhidrin α-amino asit ile etkileşir, onu hidroksi gruplarının bölünme bölgesine bağlar ve bir kondenzasyon ürünü oluşturur (Şekil 2a). Daha sonra ikincisi yok edilir ve ara amin, aldehit ve karbon dioksit salınır (Şekil 2b). Katılırken nihai üründenninhidrin, Rueman mor yapısında (diketonhidrindenketohidrinamin, Şekil 2c) sentezlenir. Ayrıca, ara aminden (indirgenmiş ninhidrin) olası hidrindantinin (indirgenmiş ninhidrin) oluşumu da belirtilmiştir, bu da amonyak (daha kesin olarak, amonyum hidroksit) varlığında, reaktifin kendisinin fazlalığı ile bir renklendirici bileşiğe dönüşür (Şekil 2d).
Hidrindantinin oluşumu, hidrojen sülfürün ninhidrin molekülüne etki etmesiyle Rueman'ın kendisi tarafından kanıtlandı. Bu bileşik sodyum karbonat Na2CO3 içinde çözünebilir ve çözeltiyi koyu kırmızıya boyar. Seyreltik hidroklorik asit eklendiğinde hidrindantin çöker.
Büyük olasılıkla, ara amin, hidridantin, ninhidrin ve boyanın yapısı, ısıtıldığında kararsızlıkları nedeniyle, birkaç ek aşamanın varlığına izin veren bir miktar dengededir.
Bu mekanizma, yapının geri kalanının –NH2'den elimine edilmesinden kaynaklanan yan ürünler hariç, diğer amino bileşikleri ile ninhidrin reaksiyonunu açıklamak için uygundur., -NH veya -N.
Biuret testi ve proteinlere karşı diğer reaksiyonlar
Protein olmayan yapıların bile peptit bağları için kalitatif analiz, yalnızca yukarıdaki reaktifin katılımıyla gerçekleşemez. Bununla birlikte, proteinlere karşı bir ninhidrin reaksiyonu durumunda, etkileşim –CO-NH‒ grupları boyunca değil, amin grupları boyunca gerçekleşir. Amino bileşikleri ile çözeltiye iyonların eklenmesi ile karakterize edilen bir "biüret reaksiyonu" vardır.bir alkali ortamda CuSO4 veya Cu(OH)2'den iki değerli bakır (Şekil 3).
Analiz sırasında, gerekli yapıların varlığında, peptit bağlarının bir reaktifi diğerinden ayıran bir renk kompleksine bağlanması nedeniyle çözelti koyu maviye döner. Bu nedenle biüret ve ninhidrin reaksiyonları –CO-NH‒ grubu ile protein ve protein olmayan yapılarla ilgili olarak evrenseldir.
Siklik amino asitleri belirlerken, nitratlandığında sarı bir renk veren konsantre bir nitrik asit HNO3 çözeltisi ile bir ksantoprotein reaksiyonu kullanılır. Derideki bir damla reaktif de deri hücrelerindeki amino asitlerle reaksiyona girerek sarı bir renk sergiler. Nitrik asit yanıklara neden olabilir ve eldivenle de kullanılmalıdır.
Amino bileşikleri ile etkileşim örnekleri
A-amino asitler için ninhidrin reaksiyonu, sarı bir renk oluşumu ile reaksiyona giren renkli prolin ve hidroksiprolin yapıları dışında iyi bir görsel sonuç verir. Bu etki için olası bir açıklama, ninhidrinin bu yapılarla etkileşiminin diğer çevresel koşullarında bulundu.
Amino grubu ile reaksiyon
Test spesifik olmadığından, karışımdaki ninhidrin reaksiyonu kullanılarak alaninin görsel tespiti mümkün değildir. Bununla birlikte, kağıt kromatografisi ile, çeşitli a-amino asit numuneleri uygulanırken, bunlara sulu bir ninhidrin çözeltisi püskürtülürken ve özel bir ortamda geliştirilirken,sadece talep edilen bileşiğin değil, aynı zamanda diğer birçok bileşiğin nicel bileşimini hesaplayın.
Şematik olarak, alaninin ninhidrin ile etkileşimi aynı prensibi takip eder. Amin grubundaki reaktife bağlanır ve aktif hidronyum iyonlarının etkisi altında (H3O+) karbonda ayrılır. -azot bağı, asetaldehit (CH3COH) ve karbondioksite (CO2) ayrışır. Başka bir ninhidrin molekülü nitrojene bağlanarak su moleküllerinin yerini alır ve bir renklendirici yapı oluşur (Şekil 4).
Heterosiklik bir amino bileşiği ile reaksiyon
Prolin ile ninhidrin reaksiyonu, özellikle kromatografik analizlerde spesifiktir, çünkü bir asit ortamındaki bu tür yapılar önce sarıya döner ve sonra nötr bir ortamda mora döner. Araştırmacılar bunu, nitrojenin harici enerji seviyesini tamamlayan çok sayıda hidrojen protonunun varlığından tam olarak etkilenen ara bileşikteki döngü yeniden düzenlemesinin bir özelliği ile açıklıyor.
Heterosiklin yıkımı gerçekleşmez ve ona 4. karbon atomunda başka bir ninhidrin molekülü bağlanır. Daha fazla ısıtıldığında, nötr bir ortamda elde edilen yapı Rueman moruna dönüşür (Şekil 5).
Ana reaktifin hazırlanması
Ninhidrin testi, belirli organik ve aminoasitlerdeki amino yapıların çözünmesine bağlı olarak farklı solüsyonlarla gerçekleştirilir.inorganik bileşikler.
Ana reaktif suda %0,2'lik bir çözeltinin hazırlanmasıdır. Bu çok yönlü bir karışımdır, çünkü çoğu bileşik H2O içinde iyi çözünür. Yeni hazırlanmış bir reaktif elde etmek için, 0,2 g kimyasal olarak saf ninhidrin numunesi 100 ml su içinde seyreltilir.
Analiz edilen bazı çözeltiler için bu konsantrasyonun yetersiz olduğunu, dolayısıyla %1 veya %2'lik çözeltilerin hazırlanabileceğini belirtmekte fayda var. Bu, çeşitli amino bileşikleri sınıfları içerdiklerinden tıbbi ham maddelerden elde edilen ekstraktlar için tipiktir.
Kromatografik çalışmalar yapılırken, örneğin bir kolon aracılığıyla katı bir taşıyıcı üzerindeki bir karışımı yıkarken, çözeltiler alkol, dimetil sülfoksit, aseton ve diğer polar çözücülerde hazırlanabilir - her şey belirli çözücülere bağlı olacaktır. amino yapıları.
Uygulama
Ninhidrin reaksiyonu, çözeltideki birçok amino bileşiğini tespit etmeyi mümkün kılar ve bu da onu organik maddelerin kalitatif analizinde ilk kullanılanlardan biri haline getirir. Görsel belirleme, özellikle üzerinde yeterince çalışılmamış bitkiler, ilaçlar ve dozaj biçimlerinin yanı sıra bilinmeyen çözeltiler ve karışımlar analiz edilirken deneylerin sayısını önemli ölçüde az altır.
Adli bilimde, bu yöntem herhangi bir yüzeyde ter izlerinin varlığını belirlemek için yaygın olarak kullanılır.
Reaksiyonun spesifik olmamasına rağmen, ninhidrin reaksiyonunun kimyasal uygulamadan geri çekilmesi imkansızdır, çünkübu maddenin daha az toksik analoglarla (örneğin, oksolin) değiştirilmesi, amino gruplarına karşı daha zayıf hassasiyete sahip olduklarını ve fotometrik analizlerde iyi sonuçlar vermediklerini kanıtladı.
