Işığın inorganik ve organik ortam tarafından emilmesi ve daha fazla yeniden yayılması fosforesans veya floresansın sonucudur. Olgular arasındaki fark, ışığın emilmesi ile akışın yayılması arasındaki aralığın uzunluğudur. Floresan ile bu işlemler hemen hemen aynı anda ve fosforesans ile biraz gecikmeyle gerçekleşir.
Tarihsel arka plan
1852'de İngiliz bilim adamı Stokes ilk olarak floresansı tanımladı. Ultraviyole ışığa maruz kaldığında kırmızı ışık yayan fluorspar ile yaptığı deneylerin bir sonucu olarak yeni terimi icat etti. Stokes ilginç bir fenomene dikkat çekti. Floresan ışığın dalga boyunun her zaman uyarı ışığının dalga boyundan daha uzun olduğunu buldu.
19. yüzyılda hipotezi doğrulamak için birçok deney yapıldı. Ultraviyole ışığa maruz kaldıklarında çeşitli numunelerin floresan yaydığını gösterdiler. Diğerlerinin yanı sıra kristaller, reçineler, mineraller, klorofil,tıbbi hammaddeler, inorganik bileşikler, vitaminler, yağlar. Biyolojik analiz için boyaların doğrudan kullanımı sadece 1930'da başladı
Floresan mikroskobu açıklaması
20. yüzyılın ilk yarısında araştırmalarda kullanılan materyallerden bazıları oldukça spesifikti. Kontrast yöntemlerle elde edilemeyen göstergeler sayesinde floresan mikroskopi yöntemi hem biyomedikal hem de biyolojik araştırmalarda önemli bir araç haline gelmiştir. Elde edilen sonuçlar malzeme bilimi için küçük bir öneme sahip değildi.
Flüoresans mikroskobunun faydaları nelerdir? Yeni materyallerin yardımıyla, oldukça spesifik hücreleri ve mikroskobik bileşenleri izole etmek mümkün hale geldi. Floresan bir mikroskop, tek tek molekülleri tespit etmenizi sağlar. Çeşitli boyalar, aynı anda birkaç elementi tanımlamanıza izin verir. Ekipmanın uzaysal çözünürlüğü, sırasıyla numunenin spesifik özelliklerine bağlı olan kırınım limiti ile sınırlı olsa da, bu seviyenin altındaki moleküllerin tespiti de oldukça mümkündür. Çeşitli numuneler, ışınlamadan sonra otofloresan sergiler. Bu fenomen, petrololoji, botanik, yarı iletken endüstrisinde yaygın olarak kullanılmaktadır.
Özellikler
Hayvan dokuları veya patojenik mikroorganizmaların incelenmesi, genellikle ya çok zayıf ya da çok güçlü, spesifik olmayan otofloresans nedeniyle karmaşıktır. Ancak, içindeki değeraraştırma, belirli bir dalga boyunda uyarılan ve gerekli yoğunlukta bir ışık akısı yayan bileşenlerin malzemeye girişini sağlar. Florokromlar, yapılara (görünmez veya görünür) kendiliğinden yapışabilen boyalar olarak işlev görür. Aynı zamanda, hedeflere ve kuantum verimine göre yüksek seçicilik ile ayırt edilirler.
Floresan mikroskopisi, doğal ve sentetik boyaların ortaya çıkmasıyla yaygın olarak kullanılmaya başlandı. Spesifik emisyon ve uyarılma yoğunluğu profilleri vardı ve belirli biyolojik hedeflere yöneliktiler.
Tek tek moleküllerin tanımlanması
Genellikle, ideal koşullar altında, tek bir öğenin parıltısını kaydedebilirsiniz. Bunu yapmak için, diğer şeylerin yanı sıra, yeterince düşük dedektör gürültüsünün ve optik arka planın sağlanması gereklidir. Bir floresan molekülü, fotoağartma nedeniyle yok edilmeden önce 300.000'e kadar foton yayabilir. %20 tahsilat oranı ve süreç verimliliği ile yaklaşık 60 bin adette kayıt yapılabilmektedir.
Çığ fotodiyotlarına veya elektron çarpmasına dayalı floresan mikroskopisi, araştırmacıların tek tek moleküllerin davranışını saniyeler ve bazı durumlarda dakikalar boyunca gözlemlemelerine olanak sağladı.
Zorluklar
Temel sorun, optik arka plandan gelen gürültü bastırmadır. Filtrelerin ve lenslerin yapımında kullanılan malzemelerin birçoğunun bir miktar otofloresan sergilemesi nedeniyle, bilim adamlarının ilk aşamalardaki çabaları,Düşük floresanlı bileşenler. Ancak, sonraki deneyler yeni sonuçlara yol açtı. Özellikle, toplam iç yansımaya dayalı floresan mikroskobunun düşük arka plan ve yüksek uyarma ışık çıkışı elde ettiği bulunmuştur.
Mekanizma
Toplam iç yansımaya dayalı floresan mikroskopisinin ilkeleri, hızla bozunan veya yayılmayan bir dalga kullanmaktır. Farklı kırılma indekslerine sahip ortamlar arasındaki arayüzde ortaya çıkar. Bu durumda ışık demeti bir prizmadan geçer. Yüksek bir kırılma indeksine sahiptir.
Prizma, sulu bir çözeltiye veya düşük parametreli cama bitişiktir. Işık demeti, kritik açıdan daha büyük bir açıyla kendisine yönlendirilirse, demet arayüzden tamamen yansır. Bu fenomen, sırayla, yayılmayan bir dalgaya yol açar. Başka bir deyişle, 200 nanometreden daha az bir mesafede daha düşük kırılma indeksine sahip bir ortama nüfuz eden bir elektromanyetik alan üretilir.
Yayılmayan bir dalgada, ışık yoğunluğu floroforları uyarmak için oldukça yeterli olacaktır. Ancak, istisnai olarak sığ derinliği nedeniyle hacmi çok küçük olacaktır. Sonuç, düşük seviyeli bir arka plandır.
Değiştirme
Toplam iç yansımaya dayalı floresan mikroskopisi, epi-aydınlatma ile gerçekleştirilebilir. Bu, artan sayısal açıklığa sahip (en az 1.4, ancak 1.45-1.6'ya ulaşması arzu edilir) lenslerin yanı sıra kısmen aydınlatılmış bir cihaz alanı gerektirir. İkincisi küçük bir nokta ile elde edilir. Daha fazla tekdüzelik için, içinden akışın bir kısmının engellendiği ince bir halka kullanılır. Toplam yansımanın gerçekleştiği kritik bir açı elde etmek için, lenslerde ve mikroskop kapak camında daldırma ortamının yüksek düzeyde kırılması gerekir.
