Moleküler biyolojik araştırma yöntemleri modern tıp, adli tıp ve biyolojide büyük rol oynamaktadır. DNA ve RNA araştırmalarındaki gelişmeler sayesinde, bir kişi bir organizmanın genomunu inceleyebilir, bir hastalığın nedensel ajanını belirleyebilir, bir asit karışımında istenen nükleik asidi tanıyabilir, vb.
Moleküler biyolojik araştırma yöntemleri. Bu nedir?
70'lerde ve 80'lerde, bilim adamları ilk kez insan genomunu deşifre etmeyi başardılar. Bu olay, genetik mühendisliği ve moleküler biyolojinin gelişimine ivme kazandırdı. DNA ve RNA'nın özelliklerinin incelenmesi, bir hastalığı teşhis etmek için bu nükleik asitleri kullanmanın artık mümkün olmasına yol açmıştır, genleri inceleyin.
DNA ve RNA elde etme
Moleküler biyolojik teşhis yöntemleri, başlangıç materyalinin varlığını gerektirir: daha sıklıkla bunlar nükleik asitlerdir. Bu maddeleri canlı organizmaların hücrelerinden izole etmenin birkaç yolu vardır. Her birinin kendi avantajları ve dezavantajları vardır ve gereklidir.saf nükleik asitleri izole etmek için bir yöntem seçerken dikkate alın.
1. Marmur'a göre DNA elde edilmesi. Yöntem, saf DNA'nın çökeldiği bir madde karışımının alkolle işlenmesinden oluşur. Bu yöntemin dezavantajı agresif maddelerin kullanılmasıdır: fenol ve kloroform.
2. Boom'a göre DNA izolasyonu. Burada kullanılan ana madde guanidin tiyosiyanattır (GuSCN). Daha sonra özel bir tampon kullanılarak toplanabileceği özel substratlar üzerinde deoksiribonükleik asidin çökelmesine katkıda bulunur. Bununla birlikte, GuSCN bir PTC inhibitörüdür ve çökeltilmiş DNA'ya giren küçük bir kısmı bile, nükleik asitlerle çalışmada önemli bir rol oynayan polimeraz zincir reaksiyonunun seyrini etkileyebilir.
3. Kirliliklerin tortulaşması. Yöntem, çökeltilen deoksiribonükleik asit molekülleri değil, safsızlıklar olduğu için öncekilerden farklıdır. Bunu yapmak için iyon değiştiriciler kullanılır. Dezavantajı ise tüm maddelerin çökememesidir.
4. Toplu tarama. Bu yöntem, DNA molekülünün bileşimi hakkında kesin bilgiye ihtiyaç duyulmayan, ancak bazı istatistiksel verilerin elde edilmesinin gerekli olduğu durumlarda kullanılır. Bu, nükleik asit yapısının deterjanlarla, özellikle alkalilerle işlendiğinde zarar görebileceği gerçeğiyle açıklanır.
Araştırma yöntemlerinin sınıflandırılması
Tüm moleküler biyolojik araştırma yöntemleri üç büyük gruba ayrılır:
1. Amplifikasyon (birçok enzim kullanarak). Buradabirçok tanı yönteminde büyük rol oynayan PCR - polimeraz zincir reaksiyonunu ifade eder.
2. Amplifiye olmayan. Bu yöntem grubu, doğrudan nükleik asit karışımlarının çalışmasıyla ilgilidir. Örnekler 3 leke, yerinde hibridizasyon vb.
3. Spesifik bir prob DNA veya RNA'ya bağlanan bir prob molekülünden gelen bir sinyalin tanınmasına dayalı yöntemler. Bir örnek, Hibrit Yakalama Sistemidir (hc2).
Moleküler biyoloji araştırma yöntemlerinde kullanılabilecek enzimler
Birçok moleküler tanı yöntemi, çok çeşitli enzimlerin kullanımını içerir. Aşağıda en sık kullanılanlar verilmiştir:
1. Kısıtlama enzimi - DNA molekülünü gerekli parçalara "keser".
2. DNA polimeraz - çift sarmallı bir deoksiribonükleik asit molekülü sentezler.
3. Ters transkriptaz (revertaz) - bir RNA şablonunda DNA'yı sentezlemek için kullanılır.
4. DNA ligaz - nükleo titler arasında fosfodiester bağlarının oluşumundan sorumludur.
5. Eksonükleaz - deoksiribonükleik asit molekülünün terminal bölümlerinden nükleo titleri uzaklaştırır.
PCR, DNA amplifikasyonunun ana yöntemidir
Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), modern moleküler biyolojide aktif olarak kullanılmaktadır. Bu, tek bir DNA molekülünden (moleküller amplifiye edilir) çok sayıda kopyanın elde edilebildiği bir yöntemdir.
PCR'nin ana işlevleri:
- teşhishastalıklar;
- DNA segmentlerinin, genlerin klonlanması.
Bir polimeraz zincir reaksiyonu gerçekleştirmek için aşağıdaki elementler gereklidir: ilk DNA molekülü, termostabil bir DNA polimeraz (Taq veya Pfu), deoksiribonükleotit fosfatlar (azotlu baz kaynakları), primerler (1 DNA molekülü başına 2 primer) ve tüm reaksiyonların mümkün olduğu tampon sisteminin kendisi.
PCR üç adımdan oluşur: denatürasyon, primer tavlama ve uzama.
1. Denatürasyon. 94-95 santigrat derece sıcaklıkta, DNA'nın iki zinciri arasındaki hidrojen bağları kırılır ve bunun sonucunda iki tek sarmallı molekül elde ederiz.
2. Astar tavlama. 50-60 santigrat derece sıcaklıkta, tek sarmallı nükleik asit moleküllerinin uçlarına tamamlayıcılık türüne göre primerler eklenir.
3. Uzama. 72 derecelik bir sıcaklıkta, çift sarmallı deoksiribonükleik asit moleküllerinin sentezi gerçekleşir.
DNA dizileme
Moleküler biyolojik araştırma yöntemleri genellikle bir deoksiribonükleik asit molekülündeki nükleotid dizisi hakkında bilgi gerektirir. Genetik kodu belirlemek için dizileme yapılır. Geleceğin moleküler teşhisi, insan dizilemesinden elde edilen bilgilere dayanacaktır.
Aşağıdaki sıralama türleri ayırt edilir:
- Maxam-Gilbert dizilimi;
- Sanger sıralama;
- pyrosequencing;
- nano gözeneksıralama.
