Protein, tüm organizmaların temel bir bileşenidir. Moleküllerinin her biri, amino asitlerden oluşan bir veya daha fazla polipeptit zincirinden oluşur. Yaşam için gerekli bilgiler DNA veya RNA'da kodlanmış olsa da, rekombinant proteinler organizmalarda enzimatik kataliz, koruma, destek, hareket ve düzenleme dahil olmak üzere çok çeşitli biyolojik işlevleri yerine getirir. Vücuttaki işlevlerine göre bu maddeler antikorlar, enzimler, yapısal bileşen gibi farklı kategorilere ayrılabilir. Önemli işlevleri göz önüne alındığında, bu tür bileşikler yoğun bir şekilde araştırılmış ve yaygın olarak kullanılmaktadır.
Geçmişte, rekombinant bir protein elde etmenin ana yolu, onu genellikle verimsiz ve zaman alıcı olan doğal bir kaynaktan izole etmekti. Biyolojik moleküler teknolojideki son gelişmeler, bakteri, maya, böcek hücreleri ve memeli hücreleri gibi maddeler için belirli bir madde grubunu kodlayan DNA'nın bir ekspresyon vektörüne klonlanmasını mümkün kılmıştır.
Basitçe söylemek gerekirse, rekombinant proteinler eksojen DNA ürünleri tarafındanyaşayan hücreler. Bunları elde etmek genellikle iki ana adımı içerir:
- Bir molekülü klonlamak.
- Protein ifadesi.
Şu anda böyle bir yapının üretilmesi tıpta ve biyolojide kullanılan en güçlü yöntemlerden biridir. Kompozisyon, araştırma ve biyoteknolojide geniş bir uygulama alanına sahiptir.
Tıbbi yönlendirme
Rekombinant proteinler diyabet, kanser, bulaşıcı hastalıklar, hemofili ve anemi gibi çeşitli hastalıklar için önemli tedaviler sağlar. Bu tür maddelerin tipik formülasyonları, antikorları, hormonları, interlökinleri, enzimleri ve antikoagülanları içerir. Terapötik kullanım için rekombinant formülasyonlara artan bir ihtiyaç vardır. Tedavi yöntemlerini genişletmenize olanak tanır.
genetiği değiştirilmiş rekombinant proteinler, terapötik ilaç pazarında önemli bir rol oynar. Formülasyonları yüksek kaliteli, doğala benzer maddeler üretebildiğinden, memeli hücreleri şu anda en terapötik ajanları üretmektedir. Ek olarak, iyi genetik, hızlı büyüme ve yüksek üretkenlik nedeniyle E. coli'de birçok onaylanmış rekombinant terapötik protein üretilir. Ayrıca bu maddeye dayalı ilaçların geliştirilmesi üzerinde de olumlu etkisi vardır.
Araştırma
Rekombinant proteinlerin elde edilmesi farklı yöntemlere dayanmaktadır. Maddeler, vücudun temel ve temel ilkelerini bulmaya yardımcı olur. Bu moleküller tanımlamak ve belirlemek için kullanılabilirbelirli bir gen tarafından kodlanan maddenin yeri ve hücre sinyalizasyonu, metabolizma, büyüme, replikasyon ve ölüm, transkripsiyon, translasyon ve makalede tartışılan bileşiklerin modifikasyonu gibi çeşitli hücresel aktivitelerdeki diğer genlerin işlevini ortaya çıkarmak için.
Bu nedenle, gözlemlenen bileşim genellikle moleküler biyoloji, hücre biyolojisi, biyokimya, yapısal ve biyofiziksel çalışmalar ve diğer birçok bilim alanında kullanılmaktadır. Aynı zamanda rekombinant proteinlerin elde edilmesi uluslararası bir uygulamadır.
Bu tür bileşikler, hücreler arası etkileşimleri anlamada faydalı araçlardır. ELISA ve immünohistokimya (IHC) gibi çeşitli laboratuvar yöntemlerinde etkili oldukları kanıtlanmıştır. Rekombinant proteinler, enzim deneyleri geliştirmek için kullanılabilir. Bir çift uygun antikorla birlikte kullanıldığında hücreler, yeni teknolojiler için standartlar olarak kullanılabilir.
Biyoteknoloji
Amino asit dizisi içeren rekombinant proteinler ayrıca endüstride, gıda üretiminde, tarımda ve biyomühendislikte kullanılır. Örneğin, hayvancılıkta, yem bileşenlerinin besin değerini artırmak, maliyetleri ve atıkları az altmak, hayvan bağırsak sağlığını desteklemek, üretkenliği artırmak ve çevreyi iyileştirmek için gıdalara enzimler eklenebilir.
Ayrıca laktik asit bakterileri (LAB) uzun sürefermente gıdalar üretmek için kullanılmıştır ve yakın zamanda LAB, örneğin insan, hayvan ve besin sindirimini iyileştirmek için yaygın olarak kullanılabilen bir amino asit dizisi içeren rekombinant proteinlerin ekspresyonu için geliştirilmiştir.
Ancak, bu maddelerin de sınırlamaları vardır:
- Bazı durumlarda, rekombinant proteinlerin üretimi karmaşık, maliyetli ve zaman alıcıdır.
- Hücrelerde üretilen maddeler doğal formlarla eşleşmeyebilir. Bu fark, terapötik rekombinant proteinlerin etkinliğini az altabilir ve hatta yan etkilere neden olabilir. Ayrıca bu fark, deneylerin sonuçlarını etkileyebilir.
- Tüm rekombinant ilaçlarla ilgili temel sorun immünojenisitedir. Tüm biyoteknoloji ürünleri bir çeşit immünojenisite sergileyebilir. Yeni terapötik proteinlerin güvenliğini tahmin etmek zordur.
Genel olarak, biyoteknolojideki gelişmeler, çeşitli uygulamalar için rekombinant proteinlerin üretimini artırdı ve kolaylaştırdı. Hala bazı dezavantajları olmasına rağmen, maddeler tıpta, araştırmalarda ve biyoteknolojide önemlidir.
Hastalık bağlantısı
rekombinant protein insanlara zararlı değildir. Belirli bir ilacın veya besin öğesinin geliştirilmesinde genel molekülün yalnızca ayrılmaz bir parçasıdır. Birçok tıbbi çalışma, FGFBP3 proteininin (kıs altılmış BP3) obez farelerin bir laboratuvar suşunda zorla ekspresyonunun, vücut yağlarında önemli bir azalma gösterdiğini göstermiştir.kitle, genetik yatkınlığa rağmen kullanmaktır.
Bu denemelerin sonuçları, FGFBP3 proteininin tip 2 diyabet ve yağlı karaciğer hastalığı gibi metabolik sendromla ilişkili bozukluklar için yeni bir tedavi sunabileceğini gösteriyor. Ancak BP3 yapay bir ilaç değil, doğal bir protein olduğundan, rekombinant insan BP3'ün klinik denemeleri, klinik öncesi çalışmaların son turundan sonra başlayabilir. Açık, yani, bu tür çalışmaların yürütülmesinin güvenliği ile ilgili nedenler var. Rekombinant protein, aşamalı olarak işlenmesi ve saflaştırılması nedeniyle insanlara zararlı değildir. Moleküler düzeyde de değişiklikler oluyor.
İmmünoterapinin kilit oyuncularından biri olan PD-L2, 2018 Nobel Fizyoloji veya Tıp Ödülü'ne aday gösterildi. ABD'den Prof. James P. Allison ve Japonya'dan Prof. Tasuku Honjo tarafından başlatılan bu çalışma, melanom, akciğer kanseri ve diğerleri gibi kanserlerin kontrol noktası immünoterapisine dayalı tedavisine yol açmıştır. Yakın zamanda, AMSBIO, immünoterapi serisine önemli bir yeni ürün olan PD-L2/TCR aktivatörü - CHO Rekombinant Hücre Hattı'nı ekledi.
Kavram kanıtı deneylerinde, H. Long Zheng, MD, Profesör Robert B. Adams ve UAB School of Patoloji Anabilim Dalı Laboratuvar Tıbbı Direktörü tarafından yönetilen Birmingham'daki Alabama Üniversitesi'ndeki araştırmacılar Tıp, potansiyel bir tedavinin, nadir görülen ancak ölümcül bir kanama bozukluğu olan TTP'nin altını çizdi.
Bunun sonuçlarıçalışmalar, rADAMTS13 yüklü trombositlerin transfüzyonunun konjenital ve immün aracılı TTP ile ilişkili arteriyel tromboz için yeni ve potansiyel olarak etkili bir terapötik yaklaşım olabileceğini ilk kez göstermektedir.
Rekombinant protein sadece bir besin maddesi değil aynı zamanda geliştirilmekte olan ilacın bileşimindeki bir ilaçtır. Bunlar, şimdi tıpta yer alan ve tüm yapısal unsurlarının incelenmesiyle ilgili olan alanlardan sadece birkaçıdır. Uluslararası uygulamanın gösterdiği gibi, bir maddenin yapısı moleküler düzeyde insan vücudundaki birçok ciddi sorunla başa çıkmayı mümkün kılar.
Aşı geliştirme
Rekombinant protein, modellenebilen belirli bir molekül grubudur. Benzer bir özellik aşıların geliştirilmesinde kullanılır. Edinburgh Üniversitesi ve Pirbright Enstitüsü'nden araştırmacılar, özel bir rekombinant virüs enjeksiyonunun kullanılması olarak da bilinen yeni bir aşılama stratejisinin, risk altındaki milyonlarca tavuğu ciddi bir solunum yolu hastalığına karşı koruyabileceğini söyledi. Bu aşılar, mikropları vücut hücrelerine sokmak için bir virüs veya bakterinin zararsız veya zayıf versiyonlarını kullanır. Bu durumda uzmanlar, zararsız bir virüsün iki versiyonunu oluşturmak için aşı olarak farklı spike proteinlere sahip rekombinant virüsleri kullandılar. Bu bağlantı etrafında inşa edilmiş birçok farklı ilaç var.
Rekombinant protein ticari adları ve analogları aşağıdaki gibidir:
- "Fortelizin".
- "Z altrap".
- "Eylea".
Bunlar çoğunlukla antikanser ilaçlarıdır, ancak bu aktif maddeyle ilişkili başka tedavi alanları da vardır.
Nature Communications adlı bilimsel dergide yayınlanan yeni bir araştırmaya göre, insanları hem Lassa ateşi hem de kuduza karşı korumak için tasarlanan LASSARAB olarak da adlandırılan yeni bir aşı, klinik öncesi çalışmalarda umut verici sonuçlar verdi. İnaktive edilmiş bir rekombinant aşı adayı, zayıflamış bir kuduz virüsü kullanıyor.
Araştırma ekibi, aşının hem Lassa hem de kuduz hücrelerinde yüzey proteinlerini ifade etmesi için bir kuduz virüsü vektörüne Lassa virüsü genetik materyali yerleştirdi. Bu yüzey bileşikleri, bulaşıcı ajanlara karşı bir bağışıklık tepkisi ortaya çıkarır. Bu aşı daha sonra taşıyıcıyı yapmak için kullanılan canlı kuduz virüsünü "yok etmek" için etkisizleştirildi.
Yöntemleri Alma
Bir madde üretmek için birkaç sistem vardır. Bir rekombinant protein elde etmek için genel yöntem, sentezden biyolojik materyalin elde edilmesine dayanır. Ama başka yollar da var.
Şu anda beş ana ifade sistemi vardır:
- E. coli ifade sistemi.
- Maya ifade sistemi.
- Böcek hücre ifade sistemi.
- Memeli hücre ifade sistemi.
- Hücresiz protein ifade sistemi.
İkinci seçenek özellikle transmembran proteinlerin ekspresyonu için uygundurve toksik bileşikler. Son yıllarda, geleneksel hücre içi yöntemlerle ifade edilmesi zor olan maddeler, in vitro olarak hücrelere başarılı bir şekilde entegre edilmiştir. Belarus'ta rekombinant proteinlerin üretimi yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu sorunla ilgilenen çok sayıda devlete ait işletme var.
Hücresiz Protein Sentez Sistemi, hücresel ekstraktların enzimatik sisteminde transkripsiyon ve translasyon için gerekli çeşitli substratları ve enerji bileşiklerini ekleyerek hedef maddelerin sentezlenmesi için hızlı ve verimli bir yöntemdir. Son yıllarda, karmaşık, toksik membranlar gibi madde türleri için hücresiz yöntemlerin avantajları yavaş yavaş ortaya çıkmış ve biyofarmasötik alanındaki potansiyel uygulamalarını göstermiştir.
Hücresiz teknoloji, geleneksel rekombinant ekspresyondan sonra çözülmesi zor olan karmaşık modifikasyon işlemlerine ulaşmak için doğal olarak oluşmayan çeşitli amino asitleri kolayca ve kontrollü bir şekilde ekleyebilir. Bu tür yöntemler, yüksek uygulama değerine ve virüs benzeri partiküller kullanılarak ilaç dağıtımı ve aşı geliştirme potansiyeline sahiptir. Çok sayıda zar proteini, serbest hücrelerde başarıyla eksprese edilmiştir.
Kompozisyonların ifadesi
Rekombinant protein CFP10-ESAT 6 üretilir ve aşılar oluşturmak için kullanılır. Böyle bir tüberküloz alerjeni, bağışıklık sistemini güçlendirmenize ve antikor geliştirmenize izin verir. Genel olarak moleküler çalışmalar, yapı, fonksiyon, modifikasyonlar, lokalizasyon veya etkileşimler gibi bir proteinin herhangi bir yönünün incelenmesini içerir. KeşfetmekSpesifik maddelerin iç süreçleri nasıl düzenlediğine göre, araştırmacılar genellikle ilgi ve fayda sağlayan fonksiyonel bileşikler üretmek için araçlara ihtiyaç duyarlar.
Proteinlerin boyutu ve karmaşıklığı göz önüne alındığında, kimyasal sentez bu çaba için uygun bir seçenek değildir. Bunun yerine, canlı hücreler ve onların hücresel makineleri, sağlanan genetik şablonlara dayalı maddeler oluşturmak ve inşa etmek için genellikle fabrikalar olarak kullanılır. Rekombinant protein ekspresyon sistemi daha sonra bir ilaç oluşturmak için gerekli yapıyı oluşturur. Ardından, farklı ilaç kategorileri için gerekli malzemenin seçimi gelir.
Proteinlerden farklı olarak, DNA'nın sentetik olarak veya yerleşik rekombinant teknikler kullanılarak in vitro olarak oluşturulması kolaydır. Bu nedenle, eklenmiş haberci dizileri veya afinite etiketi dizileri olsun veya olmasın, spesifik genlerin DNA şablonları, izlenen maddenin ekspresyonu için şablonlar olarak tasarlanabilir. Bu tür DNA şablonlarından türetilen bu tür bileşiklere rekombinant proteinler denir.
Bir maddenin ifadesine yönelik geleneksel stratejiler, hücrelerin bir şablon içeren bir DNA vektörüyle transfekte edilmesini ve ardından istenen proteini kopyalayıp tercüme etmek için hücrelerin kültürlenmesini içerir. Tipik olarak, hücreler daha sonra sonraki saflaştırma için eksprese edilen bileşiği özütlemek üzere parçalanır. Rekombinant protein CFP10-ESAT6 bu şekilde işlenir ve olası bir saflaştırma sisteminden geçer.toksinlerin oluşumu. Ancak bundan sonra sentezlenerek aşıya dönüştürülür.
Moleküler maddeler için hem prokaryotik hem de ökaryotik in vivo ekspresyon sistemleri yaygın olarak kullanılmaktadır. Sistem seçimi, protein tipine, fonksiyonel aktivite gereksinimine ve istenen verime bağlıdır. Bu ifade sistemleri arasında memeliler, böcekler, mayalar, bakteriler, algler ve hücreler bulunur. Her sistemin kendi avantajları ve zorlukları vardır ve belirli bir uygulama için doğru sistemi seçmek, incelenen maddenin başarılı bir şekilde ifade edilmesi için önemlidir.
Memelilerden ifade
Rekombinant proteinlerin kullanımı, çeşitli seviyelerde aşıların ve ilaçların geliştirilmesine izin verir. Bunun için bu madde elde etme yöntemi kullanılabilir. Memeli ekspresyon sistemleri, fizyolojik olarak ilgili ortamları nedeniyle en doğal yapıya ve aktiviteye sahip olan hayvanlar aleminden proteinler üretmek için kullanılabilir. Bu, yüksek düzeyde çeviri sonrası işleme ve işlevsel aktivite ile sonuçlanır. Memeli ekspresyon sistemleri, hücre bazlı fonksiyonel deneylerde kullanım için antikorlar, kompleks proteinler ve bileşikler üretmek için kullanılabilir. Ancak, bu faydalar daha katı kültür koşullarıyla birleştirilir.
Memeli ekspresyon sistemleri, ekspresyon yapısının konakçı genoma entegre edildiği stabil hücre hatları yoluyla veya geçici olarak proteinler üretmek için kullanılabilir. Bu tür sistemler birden fazla deneyde kullanılabilirken, zamanüretim, bir ila iki hafta içinde büyük miktarda madde üretebilir. Bu tür rekombinant protein biyoteknolojisi yüksek talep görüyor.
Bu geçici, yüksek verimli memeli ekspresyon sistemleri, süspansiyon kültürleri kullanır ve litre başına gram verebilir. Ek olarak, bu proteinler, diğer ekspresyon sistemlerine kıyasla daha fazla doğal katlanma ve glikosilasyon gibi translasyon sonrası modifikasyonlara sahiptir.
Böcek İfadesi
Rekombinant protein üretme yöntemleri memelilerle sınırlı değildir. 1 litre arıtılmış sıvı başına maddenin verimi çok daha düşük olmasına rağmen, üretim maliyetleri açısından daha verimli yollar da vardır.
Böcek hücreleri, memeli sistemlerine benzer modifikasyonlarla yüksek seviyeli bir proteini ifade etmek için kullanılabilir. Rekombinant bakulovirüs üretmek için kullanılabilecek ve daha sonra böcek hücrelerinde ilgilenilen maddeyi çıkarmak için kullanılabilecek birkaç sistem vardır.
Rekombinant proteinlerin ekspresyonları kolayca ölçeklenebilir ve moleküllerin büyük ölçekli birleştirilmesi için yüksek yoğunluklu süspansiyon kültürüne uyarlanabilir. Memeli maddesinin doğal bileşimine işlevsel olarak daha benzerler. Verim 500 mg/L'ye kadar çıkabilmesine rağmen, rekombinant bakulovirüs üretimi zaman alıcı olabilir ve kültür koşulları prokaryotik sistemlere göre daha zordur. Ancak, daha güneyde ve daha sıcak ülkelerde, benzer biryöntem daha verimli olarak kabul edilir.
Bakteriyel ifade
Rekombinant proteinlerin üretimi bakterilerin yardımıyla kurulabilir. Bu teknoloji, yukarıda açıklananlardan çok farklıdır. Bakteriyel protein ekspresyon sistemleri popülerdir çünkü bakterilerin kültürü kolaydır, hızlı büyürler ve yüksek rekombinant formülasyon verimi verirler. Bununla birlikte, bakterilerde ifade edilen çok alanlı ökaryotik maddeler, hücreler gerekli translasyon sonrası modifikasyonları veya moleküler katlamayı gerçekleştirecek donanıma sahip olmadığı için genellikle işlevsizdir.
Ayrıca, birçok protein, sert denatüratörler ve müteakip hantal moleküler yeniden katlama prosedürleri olmadan geri kazanılması çok zor olan inklüzyon molekülleri olarak çözünmez hale gelir. Bu yöntemin çoğunlukla hala büyük ölçüde deneysel olduğu düşünülmektedir.
Hücresiz ifade
Stafilokinazın amino asit dizisini içeren rekombinant protein biraz farklı bir şekilde elde edilir. Kullanımdan önce birkaç sistem gerektiren birçok enjeksiyon türüne dahildir.
Hücresiz protein ekspresyonu, translasyon açısından uyumlu tam hücre özleri kullanan bir maddenin in vitro sentezidir. Prensipte, tam hücre özleri, transkripsiyon, çeviri ve hatta çeviri sonrası modifikasyon için gerekli tüm makromolekülleri ve bileşenleri içerir.
Bu bileşenler arasında RNA polimeraz, düzenleyici protein faktörleri, transkripsiyon formları, ribozomlar ve tRNA bulunur. eklerkenkofaktörler, nükleo titler ve spesifik bir gen şablonu, bu ekstraktlar birkaç saat içinde ilgilenilen proteinleri sentezleyebilir.
Büyük ölçekli üretim için sürdürülebilir olmasa da, hücresiz veya in vitro protein ekspresyonu (IVT) sistemleri, geleneksel in vivo sistemlere göre bir dizi avantaj sunar.
Hücresiz ekspresyon, hücre kültürü gerektirmeden rekombinant formülasyonların hızlı sentezine izin verir. Hücresiz sistemler, proteinleri modifiye amino asitlerle etiketlemeyi ve ayrıca hücre içi proteazlar tarafından hızlı proteolitik bozunmaya uğrayan bileşikleri ifade etmeyi mümkün kılar. Ek olarak, hücresiz bir yöntem kullanarak aynı anda birçok farklı proteini eksprese etmek daha kolaydır (örneğin, birçok farklı rekombinant DNA şablonundan küçük ölçekli ekspresyonla protein mutasyonlarını test etmek). Bu temsili deneyde, insan kaspaz-3 proteinini ifade etmek için IVT sistemi kullanıldı.
Sonuçlar ve geleceğe yönelik beklentiler
Rekombinant protein üretimi artık olgun bir disiplin olarak görülebilir. Bu, saflaştırma ve analizdeki sayısız artan iyileştirmelerin sonucudur. Şu anda, hedef proteinin üretilememesi nedeniyle ilaç keşif programları nadiren durdurulmaktadır. Birkaç rekombinant maddenin ekspresyonu, saflaştırılması ve analizi için paralel işlemler artık dünya çapında birçok laboratuvarda iyi bilinmektedir.
Protein kompleksleri ve yapımında artan başarıçözünürleştirilmiş membran yapıları, talebi karşılamak için daha fazla değişiklik gerektirecektir. Daha düzenli bir protein tedariki için etkili sözleşmeli araştırma kuruluşlarının ortaya çıkması, bu yeni zorlukların üstesinden gelmek için bilimsel kaynakların yeniden tahsis edilmesini sağlayacaktır.
Ayrıca, paralel iş akışları, geleneksel küçük moleküllü ilaç keşif projeleriyle birlikte yeni hedef tanımlama ve gelişmiş tarama sağlamak için izlenen maddenin eksiksiz kitaplıklarının oluşturulmasına izin vermelidir.
